25-羥基維生素D（25-OH-VD）
該系列產(chǎn)品已獲得發(fā)明專利，專利號為ZL202311497182.3。
產(chǎn)品參數(shù)
| 名稱 | 25-羥基維生素D抗體（25-OH-VD antibody） | |
| 貨號 | R483k3 | R484j4 |
| 類型 | 單克隆抗體 | |
| 宿主 | 兔 | |
| 反應物種 | 人 | |
| 應用平臺 推薦配對 |
化學發(fā)光 | 免疫層析 |
| R484j4（捕獲）-R483k3（檢測） | R483k3（捕獲）-R484j4（檢測） | |
| 純度 | Protein A/G純化，純度>95% | |
| 緩沖液 | 1xPBS，pH 7.4 | |
| 儲存 | -20℃或更低溫度，分裝保存，避免反復凍融 | |
標記抗體及抗體偶聯(lián)磁珠
| 名稱 | 貨號 | 標記/偶聯(lián) | 推薦配對 | 推薦平臺 |
| 25-羥基維生素D夾心法 （25-OH-VD）標記抗體 |
L216u1 | AE | L217u1（捕獲） L216u1（檢測） |
化學發(fā)光（AE） |
| L217u1 | Biotin | |||
| 25-羥基維生素D夾心法 （25-OH-VD）抗體偶聯(lián)磁珠 |
B200t1 | 羧基（COOH） 修飾磁珠 |
B200t1（捕獲） L216u1（檢測） |
|
| B201t1 | 對甲苯磺?；═osyl） 修飾磁珠 |
B201t1（捕獲） L216u1（檢測） |
||
| B202t1 | 鏈霉親和素（SA） 修飾磁珠 |
B202t1（捕獲） L216u1（檢測） |
發(fā)光大包裝試劑
| 名稱 | 貨號 | 推薦平臺 | 方法學 |
| 25-羥基維生素D（25-OH-VD）發(fā)光大包裝試劑 | Q80h1 | 化學發(fā)光（AE） | 夾心法 |
解離劑
| 名稱 | 貨號 | 推薦平臺 | 樣本稀釋比例 |
| 25-羥基維生素D（25-OH-VD）中性解離劑 | D10a1 | 化學發(fā)光（AE、ALP） | 10:50 |
產(chǎn)品數(shù)據(jù)
1.校準曲線——化學發(fā)光（AE）平臺
用V2.0版、V3.0版25-OH-VD大包裝試劑（Q80h1）分別檢測濃度范圍為0-147.04ng/mL的25-OH-VD校準品，升級后的信噪增益幅度顯著提升，尤其是低端。
| 校準品 | 濃度 （ng/mL） |
Q80h1-V2.0版 ?RLU |
Q80h1-V3.0版 RLU |
| S1 | 0.00 | 254 | 988 |
| S2 | 0.53 | 7866 | 55199 |
| S3 | 2.45 | 48364 | 172199 |
| S4 | 8.97 | 137856 | 363852 |
| S5 | 27.55 | 835688 | 1358846 |
| S6 | 66.23 | 2596874 | 2864657 |
| S7 | 147.04 | 5986321 | 6336428 |
表1.VD校準曲線數(shù)據(jù)
2.靈敏度——化學發(fā)光（AE）平臺
用V2.0版、V3.0版Q80h1分別對零濃度稀釋液重復測定20次，計算最低檢測限，結果顯示升級后的Q80h1低端檢測靈敏度顯著提升。
| 名稱 | 濃度 （ng/mL） |
RLU平均值 | 線性方程 |
| 校準品S1 | 0 | 254 | y=14362x+254 |
| 校準品S2 | 0.53 | 7866 | |
| 20次重復測定零濃度稀釋液RLU值 | |||
| 658 | 433 | 332 | 448 |
| 455 | 538 | 465 | 432 |
| 369 | 579 | 483 | 695 |
| 488 | 661 | 224 | 455 |
| 493 | 577 | 269 | 387 |
| RLU均值 | 472 | ||
| SD | 124.0 | ||
| 平均值+2SD | 720 | ||
| 最低檢測限（ng/mL） | 0.032 | ||
表2.最低檢測限（Q80h1-V2.0版）
| 名稱 | 濃度 （ng/mL） |
RLU平均值 | 線性方程 |
| 校準品S1 | 0 | 988 | y=102285x+988 |
| 校準品S2 | 0.53 | 55199 | |
| 20次重復測定零濃度稀釋液RLU值 | |||
| 1033 | 946 | 1103 | 894 |
| 1055 | 973 | 964 | 1022 |
| 1084 | 966 | 933 | 1036 |
| 1058 | 1024 | 964 | 1055 |
| 998 | 1138 | 1105 | 1094 |
| RLU均值 | 1022 | ||
| SD | 66.0 | ||
| 平均值+2SD | 1154 | ||
| 最低檢測限（ng/mL） | 0.002 | ||
表3.最低檢測限（Q80h1-V3.0版）
3.相關性——化學發(fā)光（AE）平臺
用V2.0版、V3.0版Q80h1分別檢測82例質譜賦值樣本（濃度范圍7.69~57ng/mL），樣本符合率（R2）分別為0.951和0.9803，升級后樣本符合率顯著提升。
圖1.VD臨床對比分析（質譜賦值-V2.0版）
圖2.VD臨床對比分析（質譜賦值-V3.0版）
| 編號 | 樣本濃度 （ng/mL） |
檢測濃度 （ng/mL） |
| 1 | 7.69 | 6.34 |
| 2 | 8.35 | 7.48 |
| 3 | 8.94 | 8.11 |
| ? | ? | ? |
| 81 | 49.08 | 51.31 |
| 82 | 57 | 55.94 |
表4.VD臨床對比分析數(shù)據(jù)（質譜賦值-V2.0版）
| 編號 | 樣本濃度 （ng/mL） |
檢測濃度 （ng/mL） |
| 1 | 7.69 | 7.68 |
| 2 | 8.35 | 7.66 |
| 3 | 8.94 | 8.47 |
| ? | ? | ? |
| 81 | 49.08 | 50.08 |
| 82 | 57 | 56.95 |
表5.VD臨床對比分析數(shù)據(jù)（質譜賦值-V3.0版）
4.試劑37℃7天熱加速穩(wěn)定性——化學發(fā)光（AE）平臺
將V2.0版、V3.0版Q80h1放置在37℃條件下，分別在0、7天時，去檢測低值和高值質控品。V2.0版試劑測得的低值質控品濃度7天跌幅為8%，高值質控品跌幅9.92%。V3.0版試劑測得的低值質控品7天跌幅為3%，高值質控品跌幅2.18%。升級后的Q80h1熱加速穩(wěn)定性大幅提升。
圖3.試劑37℃7天熱加速穩(wěn)定性（低值質控）
圖4.試劑37℃7天熱加速穩(wěn)定性（高值質控）
5.校準品穩(wěn)定性——化學發(fā)光（AE）平臺
由于小分子不穩(wěn)定，市面上主流的VD檢測試劑配套校準品多采用凍干技術儲存，通常凍干后復溶穩(wěn)定性無法保障，且成本高。歐凱V3.0版25-OH-VD大包裝試劑配備的是液體校準品，無需凍干，且開瓶穩(wěn)定（見圖5、6），機載友好；2-8℃至少可以保存1年。此外，校準品37℃7天熱加速穩(wěn)定性也依然優(yōu)秀，低值跌幅為3.2%，高值跌幅為2.4%（未展示）。
圖5.低值校準品28天開瓶穩(wěn)定性
圖6.高值校準品28天開瓶穩(wěn)定性
為滿足客戶需求，打造高品質試劑，結合市場調研和用戶反饋意見，南京歐凱生物對25-OH-VD發(fā)光大包裝試劑（Q80h1）的核心原料及試劑性能進行了全方位的優(yōu)化。升級版Q80h1試劑檢測靈敏度與線性兼具；在降低非特異性背景噪音的同時，大幅提高信號強度。與初代試劑相比，整體信噪比提升約45倍。
1.超強信噪比
Q80h1采用新一代小分子夾心檢測技術，其檢測靈敏度和特異性都顯著優(yōu)于競爭法，但在線性和背景噪音方面卻仍有優(yōu)化空間。為此，我們對Q80h1的核心原料進行了升級，升級后的背景噪音有效降低，信號增益幅度更大，區(qū)分度也更高。低端信噪比提升了15倍，高端信噪比提升了近45倍。
| 校準品 | 濃度 （ng/mL） |
RLU |
| S1 | 0.00 | 195 |
| S2 | 1.15 | 12217 |
| S3 | 3.44 | 26591 |
| S4 | 15.71 | 208683 |
| S5 | 31.91 | 842490 |
| S6 | 70.33 | 2731118 |
| S7 | 153.86 | 6567286 |
| S2/S1 | 62.65 | |
| S6/S1 | 14005.73 | |
表1.25-OH-VD信噪比（升級后）
| 校準品 | 濃度 （ng/mL） |
RLU |
| S1 | 0.00 | 14776 |
| S2 | 0.22 | 19850 |
| S3 | 1.08 | 55912 |
| S4 | 10.27 | 534999 |
| S5 | 45.02 | 2464797 |
| S6 | 75.15 | 4585520 |
| S3/S1 | 3.78 | |
| S6/S1 | 310.34 | |
表2.25-OH-VD信噪比（升級前）
2. 比標質譜金標準
用Q80h1檢測106例質譜賦值樣本（濃度范圍7.69~57ng/mL），樣本符合率（R2）可達0.9645。
| 編號 | 質譜檢測濃度 （ng/mL)） |
自測濃度 （ng/mL） |
| 1 | 7.69 | 6.89 |
| 2 | 8.35 | 9.8 |
| 3 | 8.94 | 10.21 |
| ? | ? | ? |
| 105 | 49.08 | 54.77 |
| 106 | 57 | 54.38 |
表3.VD臨床對比分析數(shù)據(jù)（質譜賦值）
圖1.VD臨床對比分析（質譜賦值）
3. 檢測VD2高濃度樣本同樣精準
臨床研究顯示：市售五大主流品牌（雅培、DiaSorin、IDS、羅氏、西門子）的25-OH-VD檢測試劑與LC-MS/MS檢測結果臨床判定一致率不到71%。當樣本中含有25-OH-VD2時，與LC-MS/MS檢測結果的相關性更低。
為驗證Q80h1對含有高濃度25-OH-VD2樣本的檢測能力，我們選取了11例25-OH-VD2含量明顯高于25-OH-VD3的VD質譜賦值樣本。用Q80h1和一款市售主流競爭法VD試劑同時對這些樣本進行檢測。結果顯示：Q80h1的檢測結果與質譜符合率依然很高（R2=0.939），而競爭法檢測結果與Q80h1、質譜均存在明顯偏差。
表4.VD臨床對比分析數(shù)據(jù)（質譜賦值VD2高濃度樣本）
化學發(fā)光平臺（AE）
1.總25-OH-VD識別能力
25-OH-VD抗體對25-OH-VD2的識別能力直接影響總25-OH-VD檢測結果的準確性。經(jīng)驗證歐凱25-OH-VD發(fā)光大包裝試劑（Q80h1）與25-OH-VD2、25-OH-VD3有很好的反應性，可有效識別樣本中的總25-OH-VD。
| 濃度 （ng/mL） |
RLU | |
| 25-OH-VD2 | 25-OH-VD3 | |
| 0.00 | 201 | 213 |
| 5.03 | 33900 | 21043 |
| 15.16 | 228481 | 155393 |
| 35.43 | 951458 | 780271 |
| 70.12 | 2720547 | 2188499 |
| 150.73 | 6429867 | 5647803 |
表5.總25-OH-VD識別能力數(shù)據(jù)
圖2.總25-OH-VD識別能力
2.最低檢測限
用Q80h1對零濃度稀釋液重復測定20次，計算最低檢測限。
| 名稱 | 濃度（ng/mL） | RLU平均值 | 線性方程 |
| 校準品S1 | 0.00 | 195 | y=10454x+195 |
| 校準品S2 | 1.15 | 12217 | |
| 零濃度稀釋液20次重復測定RLU值 | |||
| 213 | 231 | 198 | 245 |
| 205 | 241 | 193 | 265 |
| 230 | 205 | 249 | 232 |
| 232 | 232 | 208 | 322 |
| 225 | 216 | 230 | 316 |
| RLU均值 | 234 | ||
| SD | 34.1 | ||
| 平均值+2SD | 303 | ||
| 最低檢測限（ng/mL） | 0.010 | ||
表6.VD發(fā)光大包裝試劑最低檢測限
3.線性
將濃度為148ng/mL的質譜賦值高濃度樣本用樣本稀釋液稀釋為50%、20%、10%、5%和1%五個濃度。用Q80h1對高濃度樣本及五個稀釋樣本進行檢測，計算相關性。
| 百分比 | 濃度（ng/mL） | RLU | 絕對偏差 | 相對偏差 |
| 100% | 148 | 6399087 | / | 0.60% |
| 50% | 71.3 | 2961553 | / | -3.10% |
| 20% | 30.9 | 754539 | / | 4.70% |
| 10% | 14.2 | 190843 | -0.62 | / |
| 5% | 8.30 | 60302 | 0.83 | / |
| 1% | 1.41 | 15120 | -0.18 | / |
| 相關性：0.99971 | ||||
表7.VD發(fā)光大包裝試劑線性
4.重復性
利用同一批Q80h1對濃度為10.26ng/mL和50.31ng/mL的質譜賦值樣本各重復檢測10次，其測量濃度變異系數(shù)（CV）均小于3%。
| 低值樣本 | ||
| 測定值編號 | RLU | 濃度（ng/mL） |
| 1 | 97500 | 10.32 |
| 2 | 96880 | 10.28 |
| 3 | 94734 | 10.14 |
| 4 | 97811 | 10.34 |
| 5 | 93522 | 10.06 |
| 6 | 94886 | 10.15 |
| 7 | 104663 | 10.77 |
| 8 | 97966 | 10.35 |
| 9 | 95344 | 10.18 |
| 10 | 107463 | 10.94 |
| 平均值 | / | 10.35 |
| 標準差 | / | 0.28 |
| CV | 2.7% | |
表8.VD發(fā)光大包裝試劑重復性（低值）
| 高值樣本 | ||
| 測定值編號 | RLU | 濃度（ng/mL） |
| 1 | 1731067 | 50.24 |
| 2 | 1810231 | 51.83 |
| 3 | 1752956 | 50.68 |
| 4 | 1713169 | 49.88 |
| 5 | 1785816 | 51.34 |
| 6 | 1738030 | 50.38 |
| 7 | 1741512 | 50.45 |
| 8 | 1762412 | 50.87 |
| 9 | 1726412 | 50.14 |
| 10 | 1726094 | 50.31 |
| 平均值 | / | 50.61 |
| 標準差 | / | 0.592 |
| CV | 1.17% | |
表9.VD發(fā)光大包裝試劑重復性（高值）
5.準確度
將濃度為50.31ng/mL的質譜賦值高濃度樣本，按照1：9的體積比加入到濃度為10.15ng/mL的低濃度血清中，配制成濃度為14.17ng/mL的混合物，用Q80h1進行檢測，計算回收率。
| 待測物 | 測定濃度（ng/mL） | RLU | 濃度平均值 （ng/mL） |
| 高濃度樣本 | 50.35 | 1736538 | 50.42 |
| 50.22 | 1730072 | ||
| 50.68 | 1752956 | ||
| 低濃度血清 | 10.12 | 94430 | 10.22 |
| 10.21 | 95803 | ||
| 10.34 | 97811 | ||
| 混合物 | 14.16 | 170846 | 14.26 |
| 14.32 | 174539 | ||
| 14.29 | 173842 | ||
| 回收率 | 100.28% | ||
表10.VD發(fā)光大包裝試劑回收率
6.熱穩(wěn)定性
將Q80h1試劑組份分別放置于37℃培養(yǎng)箱和4℃冰箱中加速7天，分別測試高、低值樣本，比較其偏差。
| 低值樣本 | ||||
| 測定值 編號 |
RLU | 濃度（ng/mL） | ||
| 4℃7天 | 37℃7天 | 4℃7天 | 37℃7天 | |
| 1 | 93071 | 84504 | 10.03 | 9.44 |
| 2 | 94886 | 85490 | 10.15 | 9.51 |
| 3 | 92921 | 85207 | 10.02 | 9.49 |
| 偏差 | / | -5.8% | ||
表11.VD發(fā)光大包裝試劑熱穩(wěn)定性（低值）
| 高值樣本 | ||||
| 測定值 編號 |
RLU | 濃度（ng/mL） | ||
| 4℃7天 | 37℃7天 | 4℃7天 | 37℃7天 | |
| 1 | 1736040 | 1635741 | 50.34 | 48.32 |
| 2 | 1725100 | 1637724 | 50.12 | 48.36 |
| 3 | 1738527 | 1632272 | 50.39 | 48.25 |
| 偏差 | / | -4.1% | ||
表12.VD發(fā)光大包裝試劑熱穩(wěn)定性（高值）
試用申請
VD臨床診斷意義
維生素D（Vitamin D，VD）是人體健康、生長和發(fā)育必不可少的物質，其缺乏或過量與多種疾病密切相關，如骨骼肌肉疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、免疫性疾病、腎臟疾病、神經(jīng)精神疾病等。
維生素D是一種類固醇激素, 通過調節(jié)腸道吸收和腎臟重吸收作用維持機體的鈣平衡。維生素D主要包括2種類型：維生素D2（VD2）和維生素D3（VD3），VD2主要通過攝取食物獲得（約占VD總量的10%），VD3主要通過日光中的紫外線照射皮膚產(chǎn)生。體內維生素D通過與白蛋白和VD結合蛋白結合后經(jīng)血液運送至肝臟, 在肝臟分泌的25-羥化酶的參與下, 25號位羥化過程并形成25-（OH）-VD。在腎臟中, 25-（OH）-VD進一步被1α -羥化酶轉化成具有生物活性的1, 25（OH）2VD3（1, 25-dihydroxyvitamin D3, 又稱骨化三醇）。最后在DBP轉運蛋白的載運下，經(jīng)血液到達小腸、骨等靶器官中與靶器官的核受體（VDRn）或膜受體（VDRm）結合，發(fā)揮相應的生物學效應。
25-（OH）-VD是機體維生素D的主要儲存形式, 占VD總量的95%以上。由于其半衰期長（2 ~ 3周）, 并且不受血鈣和甲狀旁腺素水平的影響, 因此被公認為是客觀評價體內VD含量的最佳指標。
| 體內25羥基維生素D含量（ng/ml） | 臨床建議 |
|---|---|
| <10 | 嚴重缺乏 |
| 10-20 | 缺乏 |
| 20-30 | 不足 |
| 30-100 | 正常 |
參考文獻
1.B. Oliveri, A.G. Díaz, M. González Pernas,等. Serum 25OHD levels in adults living in the city of Buenos Aires: Importance of vitamin D supplementation[J]. Bone, 2016, 89:64.
2.Adriana S. Dusso, Alex J. Brown, Eduardo Slatopolsky. Vitamin D[J]. 2005, 289(1):F8-28.
3.Lips, Paul, Graafmans, Wilco C. Vitamin D supplementation and fracture incidence in elderly persons[J]. Annals of Internal Medicine, 1996, 124(4):400-406.
4.向偉, 丁宗一, 鄭維. 維生素D及其受體與臨床相關疾病的研究[J]. 中華兒科雜志, 2004(7).
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